Nguyễn Mậu Tuyên lớn lên khi Mạc Đăng Dung cướp ngôi nhà Lê (1527). Năm 1533, Nguyễn Kim lập Lê Trang Tông lên ngôi chống lại nhà Mạc. Năm 1545, Nguyễn Kim chết, con rể là Trịnh Kiểm lên thay. Thời Lê Trung Tông (1548-1556), Nguyễn Mậu Tuyên tìm đến gặp Trịnh Kiểm xin theo giúp.

Trịnh Kiểm dùng Mậu Tuyên làm tham mưu. Ông giúp Trịnh Kiểm bày kế trong màn trướng, lập nhiều công lao. Sang thời Lê Anh Tông (1557-1572), ông được phong làm Hữu thị lang bộ Lại, tước Nhân Nghĩa bá; sau đó lại đổi làm Hữu thị lang bộ Binh, Tường Lân bá.

Năm 1570, Trịnh Kiểm mất, hai con là Trịnh Cối và Trịnh Tùng tranh quyền. Nguyễn Mậu Tuyên đi theo Trịnh Tùng. Trịnh Cối yếu thế chạy sang hàng nhà Mạc. Ông tiếp tục làm tham mưu cho Trịnh Tùng chống nhà Mạc. Nhờ có công lao, ông được thăng tước hầu.

Năm 1573 đời Lê Thế Tông (1573-1599), Nguyễn Mậu Tuyên được đổi sang làm Đô ngự sử. Năm 1580 ông được phong làm Thượng thư bộ Công. Năm 1582, ông được điều sang làm Thượng thư bộ Hộ.